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   液晶空间光调制器在单光子及三光子显微成像中的运用

液晶空间光调制器在单光子及三光子显微成像中的运用


 

择要

诸如可变形反射镜,液晶空间光调制器(SLM)和柔性聚焦透镜之类的波前成形装配在显微成像范畴被普遍的用于像差校订,体积成像和可编程神经元引发。 个中液晶空间光调制器(SLM)是高分辨率的相位调制器,可以或许建立庞大的相位图,以在三维(3D)体积内可实现恣意的光束偏转,可实现三维(3D)体积重塑。

Meadowlark OpticsMLO)公司最新的SLM将里添补率从83.4%进步到96%,并将分辨率从512 x 512像素进步到1920 x 1152像素,同时在1064 nm处到达300 Hz的液晶相应工夫(0-2π)和845Hz的帧频,可掩盖波段:850-1650nm

本文总结了Meadowlark Optics公司新的SLM的功用,和SLM在单光子及三光子显微微镜成像运用中的上风。

 

关键词: 下相应速度,高分辨率,高效率,空间光调制器,LCOS, SLM ,液晶空间光调制器,单光子显微镜,三光子显微镜

 

引见: 

3D体积中监控和支配神经元回路的发射形式的需求鞭策了用于神经科学的初级单光子显微镜的生长。扫描单光子显微镜运用谐振(resonant stages),或运用声光偏转器光栅扫描竖立一个图象。这类体式格局可实现50 kHz的扫描速度。但是,用这种方法难以实现同时多点刺激,由于激光需求停止在每一个位置收集充足的光子以发生可用的图象或调治运动。试图经由过程增添峰值引发强度去制止这种情况是基本上遭到限定的,由于下功率激光会引发神经元的光毁伤和荧光团的光漂白。另外,传统显微镜仅限于对二维外面停止成像,而神经回路具有三维构造。深度扫描可用于构建3D图象,但速度异常缓,由于它一般经由过程以约莫20 Hz的速度扫描物镜去实现。这不足以监测在一毫秒的工夫标准上发作的神经运动。关于光遗传学研讨,需求可以或许在3D空间中静态和恣意构成多个核心的显微镜以看管和支配发射形式,而且显微镜必需可以或许停止3D成像以捕捉神经元电路的相应。

在扫描单光子/三光子显微镜的引发途径中增加液晶空间光调制器(SLM,能够将引发源分红几百个自力的核心,并以高达300 Hz的频次从新设置核心的3D位置。因而,运用SLM能够通报光芒,同时可引发多个3D位点的神经元,然后将目的细胞定位在一个体积内以监测神经回路对刺激的回响反映。那使得在大量细胞群中监测和支配神经元运动的过程可同步停止。 Yuste初次证实了SLM在光遗传学中的运用潜力,它开辟了一种基于SLM的原型显微镜,能够同时引发脑切片中的多个神经元。在那项事情中,Yuste同时在几十个神经元中成像并检测动作电位,帧频为66 Hz。那关于神经科学界去说是一个严重前进,然则事先Yuste可用的SLM限定了这项事情。

这项事情鞭策了先辈的SLMs的生长,以进步分辨率以最大化可研讨的大脑的体积,改进功率处置惩罚以增添一次可照亮的神经元的数目,而且进步液晶的相应工夫,使得鼓励工夫能够婚配神经电路静态历程。Meadowlark OpticsMLO)公司最新的HSP1920SLM分辨率从512 x 512像素进步到1920 x 1152像素,同时在1064 nm处到达300 Hz的液晶相应工夫(0-2π)和845Hz的帧频。

 

横向/轴向引发

为了使SLM引发肯定体积内的神经元,运用SLM作为成像的振幅调制器是不敷的。相反,必需将SLM用作相位调制器,而且将所需鼓励形式的傅立叶变更的全息图写入SLM。运用过渡镜,使SLM成像到物镜的后焦平面。为了应用物镜的齐数值孔径(NA),同时不捐躯引发的限定,物镜处的SLM的图象应当添补后孔。目的SLM图象中像素间距的巨细(称为有用像素间距)取决于中继光学系统(如下图)。


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引发的横向视场由可写入SLM的最小相位光栅掌握。凭据光栅方程sin(θ)= m *λ/ d,能够计算出光芒能够偏转的最大角度。那取决于设定的阶数m,波长λ和光栅d的周期,其最小值为有用像素间距的2倍。经由过程物镜的焦距将测向角度转换为样品的横向位移。下图为用1920x1152液晶空间光调制器在1064nm实现了0度,0.2度,0.4度,0.8度,1.6度的光束偏转。

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经由过程将SLM的分辨率从512 x 512进步到1920 x 1152像素,消弭了鼓励束缚取视场之间的限定。关于光遗传学来讲,期望保持xy中引发的点散布函数(PSF),因而将SLM的正方形感兴趣地区成像到物镜的后焦平面,有效地将SLM分辨率低落到1152×1152像素。 SLM的像素间距为9.2微米,使得SLM的短轴为10.6毫米。为了使SLM图象的尺寸取物镜的后孔径相婚配,中继光学器件必需将SLM的图象放大,从而将有用像素间距减小到8μm。在0,π衍射图中,最大光栅周期为2个像素,入射波长为940 nmSLM能够转向的最大角度为3.36°。与物镜焦距为7.2 mm,最大横向位移为零点四周±423μm,或xy的总横向位移为847μm。那超越了目的能够成像的视野,同时连结目的的全部NA,因而不会捐躯鼓励束缚。另外,经由过程傅里叶变换,如今能够在样本上建立1152 x 1152个核心,那只能将目的可剖析的核心应用不到1.16倍。


1总结了1920 x 1152像素SLM512 x 512像素SLM的客观规格,光学系统,侧向光束传输规格,个中SLM的图象取SLM的图象取目的后光圈的尺寸和客观利用率相婚配。 能够运用概述的方程针对差别的SLM模子复制剖析。

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1. SLM分辨率取客观规格,中继光学系统的选择和波长相结合,决意了SLM能够使光芒转向的横向视场的规格。 该表对照了当将SLM的图象取物镜的后孔径相婚配时的512×512像素SLM,当将SLM的图象添补到物镜上以捐躯鼓励束缚以婚配转向指向的视场时 目的,1920 x 1152 1152 x 1152像素图象中继到目的。 高分辨率SLMSLM的射束导向才能取目的视野相婚配,而不会捐躯鼓励束缚。

 

2总结了光学系统,1920 x 1152像素SLM512 x 512像素SLM的光学系统,轴向光束转向规格,个中SLM的图象取物镜后孔径的尺寸相婚配。

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2. SLM分辨率加上客观规格,中继光学元件的选择和波长决意了焦距从客观设想焦距的最大轴向位移的规格。 该表对照了当将SLM的图象取物镜的后孔相婚配时的512×512像素SLM,当SLM在物镜上的图象添补缺乏时,和1920×1152,个中1152×1152像素图象是 通报到目的。

 

毁伤阈值

跟着鼓励视野的增添,能够研讨更多的神经元和更大的神经回路。为了照亮视野中的多个物体,SLM将入射照明分为多个核心。跟着核心数目的增添,每一个核心的功率下落。为了增添引发目的的数目,同时连结每一个目的充足的功率以引发荧光,SLM的功率处置惩罚变得至关重要。多个身分影响功率处置惩罚。增添SLM的尺寸许可照明散布在更大的地区,涂层能够被优化以限定吸取,而且自动和被动冷却系统能够用于减缓热效应。

关于光遗传学,很多研究人员正在运用飞秒脉冲激光器。 Coherent Monaco是一款1035 nm脉冲激光器,可编程脉冲宽度局限从300飞秒(FWHMsech2 fit)到10皮秒。它具有40 uJ的最大脉冲能量,而且在1 MHz的脉冲反复频次下,激光器可输出40 W的平均功率。经由过程将入射光功率从101 MW / cm2增添到729 MW / cm21920 x 1152 SLM(型号:HSP1920-1064-HSP8)的毁伤阈值停止测试,同时在背SLM写入一系列衍射图时丈量背板温度和一阶衍射效力。当运用被动冷却系统时,因为跟着入射功率增添,背板温度增添22°C,观察到调制深度的转变。但是,在最大入射功率下,调制深度仍旧大于一个波,许可基于温度表征光学相应的才能,而且运用片上传感器作为闭环体系去连结取入射功率无关的一阶衍射效力。大概,能够将有源冷却块增加到SLM,以保持低于40°C的工作温度,从而保持一致的调制深度而取入射功率无关。

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激光参数:1MHz反复频次,280 fs脉冲宽度,6.7mm光束尺寸(1 / e2)。 最大输出功率36uJ,平均功率36W,平均功率密度= 204W / cm2,峰值功率= 128MW,峰值功率密度= 729MW / cm2。 (左)因为被动冷却系统的热效应,入射功率增添时调造深度减小(左)增添自动冷却系统许可在峰值功率密度高达729MW / cm2的状况下保持一致的调制深度。

 

相应工夫

液晶相应工夫取决于多个身分,包孕液晶层的厚度,其被优化后在最长事情波长处供应一个相位路程波,驱动器的电压和液晶质料特性。 关于光遗传学,大多数研究人员将SLM取单光子、三光子显微镜联合,而且事情在900 nm1300 nm的波长范围内。 MLO是唯一供应高速SLM的供应商,HSP1920-1064型液晶空间光调制器在1064 nm,可以或许到达300 Hz的液晶相应速度(0 - 2pi转换)845Hz的帧频(灰度图片同电脑传输到SLM速度)。

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1064 nm处,液晶从10%90%范围内上升和下落工夫小于3 ms。将核心经由过程触发翻开和触发封闭停止检测。 (左)由软件准时驱动的液晶开关。 核心被翻开和封闭探测器(显现为黄色)。 当SLM上的图象发作转变时,硬件会发生一个输出脉冲(以紫色显现),示意新图象将在1.18 ms内最先在SLM上加载。 (左)由内部硬件触发驱动的液晶开关。 当内部触发器的下落沿抵达(以蓝色显现)时,硬件将启动SLM上的图象更新。 发生输出脉冲以确认吸收到触发(以紫色显现)。 在发生输出脉冲后的1.18口试内,图象将在SLM上更新(以黄色显现,核心移入和移出检测器)。

 

相位稳定性

为了确保鼓励源在很多神经元之间分派时的同等鼓励,SLM的工夫特性变得主要。 MLO SLM运用两种战略去最大化相位稳定性。第一种战略是运用间接模仿寻址,而不是模仿运用二进制寻址取时序发抖相结合的模仿调制。第二种战略是运用可以或许以844Hz的速度革新的定制背板。高速背板革新关于减轻像素电容的电压丧失是需要的。若是背板革新较缓,则像素处的电压下落使液晶份子松懈,从而改动LC的折射率。若是背板电压的革新速度显着快于LC弛豫时间,那么SLM将具有较下的相位稳定性。

经由过程背SLM写入反复相位斜坡并丈量一阶强度去量化相稳定性。 LC份子松懈的不稳定性会致使一阶核心的强度随时间而转变。相稳定性被界说为峰到一阶核心强度的峰值取均匀核心强度的比值。关于具有ODP512 x 512像素SLM,相位纹波为3- 5%,关于高速1920 x 1152像素SLM,相位纹波为2- 4%(图6)。关于需求更高相位稳定性和高分辨率的研讨,尺度的1920 x 1152像素SLM可供应低至0.20%的相位纹波。

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波前质量(波前畸变)

单光子引发比拟,单光子引发具有更好的限定,果为由两个光子同时引发的可能性取光强度的平方成反比。因而,单光子引发以核心间隔的四次幂衰减[8]。但是,这类低引发的可能性使得操纵形式对改动核心的PSF的像差敏感。为了确保在大体积上的同等引发,校订显微镜中SLM和其他光学元件的像差是很重要的。

很多用于表征和校订像差的算法皆基于Zernike多项式。但是,对圆形孔径的依靠不适用于形貌正方形或矩形阵列的像差。曾经开辟了基于SLM的过问子孔径的替换战略[9],以确保SLM的有用地区上的像差能够被校订到λ/ 40或更好。如图7所示,因为运用了制造工艺,MLO SLM的本地波前像差很低。残留偏差被去除以确保神经元引发的衍射受限核心。


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a)原始的1920 x 1152像素SLM波前(λ/ 7 RMS)(b)运用了像差校订的波前(λ/ 20 RMS

c)已运用校订的像差曲面图。 (c)运用校订后的像差曲面图。

 

神经元引发效力

光遗传学的目的是相识神经回路的功用,和发射形式和行动之间的干系。为了获得成功,科学家需求可以或许监测和支配尽量多的神经元,并以取天然发作的电路动力学相婚配的速度复制发射形式。有很多身分决意每秒可处置惩罚多少神经元,个中一些取决于实行,另外一些取决于光学体系的极限。比方,当针对皮质深处的神经元时,因为散射形成的丧失是显着的。因为存在激光功率会致使热毁伤的阈值,因而不克不及简朴天增添入射功率以顺应散射丧失。在这种情况下,皮层所需层的有限功率将决意可被引发的神经元的数目。但是,假定一名研究人员试图将神经元定位在皮层的雷同位置,SLM的规格也将决意每秒能够定位的神经元的数目。HSP1920-1064空间光调制器较本来的ODP512SLM在神经元激活的速度方面进步了快要一倍。


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